轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測(cè)方法
 

前言

       本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。
       本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC 387）提出并歸口 。
       本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位 ： 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜作物研究所。
      本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：付偉 、杜智欣 、 王勤 、 王輩煌 、許文濤 、 吳剛 、朱水芳 、 劉曉飛 。
 
1 范圍
       本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的數(shù)字PCR方法。
       本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、大豆、油菜、水稻、馬鈴薯、苜蓿、棉花等轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)?shù)字PCR檢測(cè)。
       本標(biāo)準(zhǔn)所能達(dá)到的檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。
2 規(guī)范性引用文件
      下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是*的。 凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682         分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
GB/T 19495.1    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 通用要求和定義
GB/T 19495.3    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 核酸提取純化方法
GB/T 19495. 7   轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 抽樣和制樣方法
3 術(shù)語(yǔ)和定義
       下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1
       18srRNA基因 18srRNA gene
       轉(zhuǎn)錄自18srDNA.是細(xì)胞核糖體的組分之。
3.2
       CaMV35s啟動(dòng)子基因 CaMV35s promotor
       來(lái)自花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35s啟動(dòng)子。
3.3
       NOS終止子基因 NOS terminitor
       來(lái)自胭脂堿合成酶基因NOS的終止子。
4 原理
       數(shù)字PCR其技術(shù)原理是通過(guò)將原始PCR反應(yīng)體系進(jìn)行分割，進(jìn)而對(duì)所有小的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增并后續(xù)檢測(cè)。 通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行有限的分割，從而使整個(gè)反應(yīng)體系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速地對(duì)痕量的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行鑒定。
       現(xiàn)階段數(shù)字PCR的實(shí)現(xiàn)形式包括芯片式數(shù)字PCR與做滴式數(shù)字PCR兩種。 其中芯片式數(shù)字PCR通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)對(duì)原始反應(yīng)體系的分割，這種分割方式具有穩(wěn)定性好均一性好的優(yōu)點(diǎn)，但是這種分割方式的實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高；微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)通過(guò)產(chǎn)生微小油包水體系實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的分割。 這種分割方式具有反應(yīng)速度快．分割成本低的優(yōu)點(diǎn)，但是相對(duì)來(lái)說(shuō)，這種分割方法的穩(wěn)定性較差，而且對(duì)于數(shù)據(jù)分析的要求也相對(duì)較高 。 由于數(shù)字PCR的平臺(tái)差異，對(duì)不同數(shù)字PCR平臺(tái)進(jìn)行的數(shù)據(jù)協(xié)同分析也成為了目前數(shù)字PCR檢測(cè)方法發(fā)展的關(guān)鍵。
       本標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)通用篩選元件CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子設(shè)計(jì)選取特異性引物和探針進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果來(lái)判定CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子的外源篩選元件成分。 另外，通過(guò)芯片式數(shù)字PCR和微滴式數(shù)字PCR的協(xié)同比對(duì)，本標(biāo)準(zhǔn)方法可以在兩種平臺(tái)中達(dá)到同樣的檢測(cè)目的 。
5 試劑與材料
       除非有特殊說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T 6682規(guī)定的 水 。
5.1 DNA提取試劑盒
       推薦針對(duì)不同的樣品基質(zhì)類型選取不同的基因組提取試劑盒。
5.2 數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒
       推薦按照不同的數(shù)字PCR平臺(tái)的說(shuō)明書(shū)選取其推薦的數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒。
5.3 18srRNA基因引物和探針
       18s-F:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT'-3’
       18s-R:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
       18s-P:5’-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3’
5.4 CaMV35s啟動(dòng)子基因引物和探針
      p35s-F: 5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3'
      p35s-R: 5'-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'
      p35s-P: 5 '-VIC- CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3 '
5.5 NOS終止子基因引物和探針
      TNOS-F: 5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'
      TNOS-R: 5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'
      TNOS-P,5 '-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1l-3'
6 儀器與設(shè)備
6.1分析天平：感量0.1 mg。
6.2生物安全柜
6.3數(shù)字PCR擴(kuò)增儀。
6.4純水儀。
6.5核酸定量?jī)x。
6.6渦旋震蕩儀。
6.7其他相關(guān)儀器和設(shè)備。
6.8離心管。
6.9 不同量程移液器以及配套吸頭如下：
a)量程為 20 µL～200 µI， 10 µL～100 µL 和 2 µL～20 µL 的移液器以及配套的 200 µL 吸頭；
b)量程為 0.5 µL～10 µL 和 0.1µL～2.5 µL 的移液器以及配套的 10µL吸頭。
7 操作步驟
7. 1 抽樣
       按照 GB/T 19495.1和GB/T 19495.7 的規(guī)定執(zhí)行。
7.2 制樣
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 191195.7 的規(guī)定執(zhí)行。
7.3 試樣預(yù)處理
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19195.3 的規(guī)定執(zhí)行。
7.4 DNA模板制備
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.3 的規(guī)定執(zhí)行。
7.5 數(shù)字PCR擴(kuò)增方法
7 .5. 1 試樣數(shù)字 PCR 反應(yīng)
7.5.1.1 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因數(shù)字 PCR 反應(yīng)
       每個(gè)試樣內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因數(shù)字 PCR 反應(yīng)設(shè)置 3 個(gè)平行。 并按照表 1 的組分和終濃度配置數(shù)字 PCR 反應(yīng)體系。 反應(yīng)體系配置完成后，進(jìn)行反應(yīng)體系的分割，其中芯片法數(shù)字 PCR 通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)本步驟，微滴法數(shù)字PCR通過(guò)形成油包水結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)體系的分割。 該步驟按照不同數(shù)字 PCR 平臺(tái)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 數(shù)字PCR反應(yīng)的有效分割體系數(shù)不得低于理論分割體系數(shù)的60%。

表 1 數(shù)字 PCR 反應(yīng)體系

體系分割完成后，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)。 熒光分析步驟采用VIC單熒光通道，反應(yīng)程序如表2 所示。

表2 數(shù)字PCR反應(yīng)程序

 
7.5.1.2 外源基因p-35s與T'-NOS基因數(shù)字PCR反應(yīng)
       每個(gè)試樣外源基因數(shù)字PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。 外源基因擴(kuò)增所用反應(yīng)體系與反應(yīng)程序與7.5.1.1相同，擴(kuò)增所使用的引物探針為5.4與5.5所述引物探針。
7.5.2 對(duì)照數(shù)字PCR反應(yīng)
       在試樣數(shù)字PCR的同時(shí)．應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照。
以與試樣相同種類的非轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA作為陰性對(duì)照；以水作為空白對(duì)照。
各對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與7.5.1相同。
8.結(jié)果分析與表述
8. 1 闊值的設(shè)定
       根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中擴(kuò)增曲線的基錢或者體系中陰性分割體系的終點(diǎn)熒光值設(shè)定熒光的闊值限。 闊值限需要對(duì)陰性和陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明顯的區(qū)分。
8.2 對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果分析
       陰性對(duì)照組只有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增，空白對(duì)照組沒(méi)有任何擴(kuò)增現(xiàn)象，這表明數(shù)字PCR反應(yīng)體系正常工作，否則需要進(jìn)行重新檢測(cè) 。
8.3 試樣檢測(cè)結(jié)果分析和表述
8. 3. 1 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到了明顯的擴(kuò)增，并且外源p-35s或NOS基因的任何一個(gè)出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增現(xiàn)象， 陽(yáng)性擴(kuò)增體系內(nèi)擴(kuò)增曲線形狀良好或者其終點(diǎn)熒光信號(hào)值*過(guò)熒光閣值，這表明試樣中檢測(cè)出了p-35s 或T-NOS基因，表述為“試樣中檢測(cè)出了p-35s或NOS基因成分，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性”。
8.3.2 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到了明顯的擴(kuò)增，且其擴(kuò)增曲線形狀良好并*過(guò)闊值限，而p-35s或T-NOS基因都沒(méi)有得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)值位于闊值限之下，這表明試樣中未檢測(cè)出p-35s或T-NOS基因成分，表述為“試樣中未檢測(cè)出p-35s或T-NOS基因成分，檢測(cè)結(jié)果為陰性” 。
8.3.3 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因沒(méi)有得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)值位于闊值限之下，這表明試樣中未檢測(cè)對(duì)應(yīng)植物成分，結(jié)果表述為“試樣未檢出對(duì)應(yīng)植物成分，檢測(cè)結(jié)果為陰性’。